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輔酶（coenzyme）是一類可以將化學基團從一個酶轉移到另一個酶上的有機小分子，與酶較為松散地結合，對于特定酶的活性發揮是必要的。有許多維他命及其衍生物，如核黃素、硫胺素和葉酸，都屬于輔酶。這些化合物無法由人體合成，必須通過飲食補充。不同的輔酶能夠攜帶的化學基團也不同：NAD或NADP+攜帶氫離子，輔酶A攜帶乙酰基，葉酸攜帶甲酰基，S-腺苷基蛋氨酸也可攜帶甲酰基。
由于輔酶在酶催化反應中其化學組分發生了變化，因此可以認為輔酶是一種特殊的底物或者稱為“第二底物”。這種所謂的第二底物可以被許多酶所利用。例如，目前已知有約七百種酶可以利用輔酶NADH進行催化。
在細胞內，反應后的輔酶可以被再生，以維持其胞內濃度在一個穩定的水平上。例如，NADPH可以通過磷酸戊糖途徑和甲硫氨酸腺苷基轉移酶作用下的S-腺苷基蛋氨酸來再生。由于輔酶的再生對于維持酶反應體系的穩定是必要的，因此，輔酶再生系統獲得了大量的實驗室以及工業應用。
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